核酸浓度电泳仪测定

检测项目

DNA浓度测定：通过比较样品与已知浓度标准品的荧光强度，精确计算双链DNA的浓度。

RNA浓度测定：评估RNA样品的浓度，需注意防止RNA酶污染并使用特定的RNA分子量标准。

核酸完整性评估：观察条带的清晰度与有无拖尾现象，判断核酸是否发生降解。

基因组DNA完整性：检查高分子量基因组DNA是否呈现单一、清晰的条带，无弥散。

总RNA完整性：通过28S和18S rRNA条带的亮度比（通常约为2:1）及5S条带来判断RNA质量。

质粒DNA构型分析：区分超螺旋、线性和开环三种不同构型的质粒DNA条带。

PCR产物鉴定：确认PCR扩增产物的大小是否正确，并评估其特异性与产量。

酶切产物分析：验证限制性内切酶消化是否完全，并分析片段大小是否符合预期。

核酸样品纯度初筛：通过观察有无蛋白质、盐类或其他杂质引起的荧光背景或异常条带来初步判断纯度。

分子量大小确定：通过与DNA/RNA分子量标准（Ladder）对比，确定样品核酸片段的大致长度。

检测范围

双链DNA：适用于从pg/μL到μg/μL浓度范围的各类双链DNA样品，如基因组DNA、质粒DNA、PCR产物等。

单链DNA/RNA：可对单链核酸进行定量，但定量准确性低于双链DNA，常用于完整性评估。

高分子量核酸：特别适合评估大于1kb的高分子量基因组DNA的完整性与大致浓度。

低浓度核酸样品：通过增加上样量或使用高灵敏度染料，可检测低至纳克级别的核酸。

PCR扩增产物：广泛应用于PCR反应后产物的存在性、大小和产量的快速检测。

限制性酶切产物：用于酶切反应后的片段分离与消化完全性验证。

体外转录产物：用于分析由体外转录反应生成的RNA的大小、完整性和产量。

核酸提取物质量控：作为核酸提取后的常规质量检查步骤，评估提取效率和质量。

克隆筛选初步鉴定：在菌落PCR或质粒快速提取后，用于初步鉴定阳性克隆。

下一代测序文库质检：在构建测序文库过程中，用于检查文库片段的大小分布和浓度是否合格。

检测方法

琼脂糖凝胶制备：根据待测核酸片段大小，选择合适浓度的琼脂糖，加热溶解于缓冲液中后倒入制胶槽凝固。

核酸染料添加：在凝胶溶液冷却至约60℃时，加入溴化乙锭（EB）或其更安全的替代染料（如GelRed）。

样品制备与上样：将核酸样品与上样缓冲液混合，用微量移液器小心加入凝胶加样孔中。

电泳条件设置：将凝胶浸没于电泳缓冲液中，根据片段大小设定合适的电压（通常3-10 V/cm）和时间进行电泳。

分子量标准品使用：在相邻的加样孔中加入已知浓度的DNA/RNA分子量标准品（Ladder），作为定性与定量的参照。

荧光成像与分析：电泳结束后，在紫外或蓝光透射仪下观察荧光条带，并使用成像系统拍照记录。

半定量浓度估算：通过比较样品条带与已知浓度标准品条带的荧光强度，对样品浓度进行半定量估算。

图像软件辅助定量：利用正规的凝胶图像分析软件，通过灰度值分析对条带强度进行更精确的定量计算。

完整性判读标准