反义寡脱氧核苷酸序列验证实验

检测项目

序列长度与均一性：验证合成AS-ODN的碱基数是否符合设计，并确认产物是否为单一长度的片段，无缺失或加长序列。

碱基组成分析：确认AS-ODN中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）四种脱氧核苷酸的比例与理论值一致。

全序列测定：通过测序技术获取AS-ODN的完整碱基排列顺序，是验证其准确性的金标准。

5‘端与3’端修饰验证：检测AS-ODN分子两端是否成功引入了设计的化学修饰基团（如硫代磷酸酯、胆固醇、荧光标记等）。

纯度与杂质鉴定：分析AS-ODN样品中目标序列的百分比，并鉴定主要杂质成分，如失败序列、脱保护不完全产物等。

分子量确认：通过高精度质谱测定AS-ODN的实际分子量，与理论分子量对比，是验证序列和修饰的有效手段。

紫外吸收特性：测定其在260nm处的紫外吸收值，用于定量并计算摩尔消光系数，评估样品浓度。

溶解性与稳定性：评估AS-ODN在不同缓冲液中的溶解情况以及在储存条件下的化学稳定性。

二级结构分析：预测并检测AS-ODN自身可能形成的发卡、二聚体等二级结构，这些结构可能影响其与靶标的结合。

生物活性初筛：在细胞模型中进行初步功能实验，验证其抑制特定基因表达或蛋白质翻译的活性。

检测范围

标准长度AS-ODN：适用于长度在15-30个碱基对范围内、未经复杂修饰的传统反义寡核苷酸。

长链寡核苷酸：可扩展至长度达100个碱基甚至更长的反义序列的验证。

硫代磷酸酯修饰序列：专门针对磷酸骨架中的氧被硫原子取代的AS-ODN，这是最常见的增强稳定性修饰。

2‘-O-甲基/甲氧乙基修饰序列：针对核糖2‘位进行修饰以增强核酸酶抗性和结合亲和力的AS-ODN变体。

锁核酸修饰序列：验证含有锁核酸单体的高亲和力、高稳定性AS-ODN。

胆固醇/脂质体缀合序列：适用于末端连接了胆固醇或其他脂质分子以增强细胞摄取的AS-ODN。

荧光/生物素标记序列：验证在特定位置标记了荧光基团（如FAM、Cy系列）或生物素等报告分子的AS-ODN。

双功能/嵌合型AS-ODN：适用于同时包含多种不同化学修饰或具有特殊功能域（如适配体）的复杂设计。

粗品与纯化后样品：涵盖从合成后粗产物到经过HPLC、PAGE等方法纯化后的终产品全流程检测。

制剂中的AS-ODN：对已配制在脂质纳米粒、胶束或其他递送系统制剂中的AS-ODN进行释放和完整性分析。

检测方法

毛细管电泳法：基于迁移时间分离不同长度的核酸片段，是分析长度均一性和纯度的快速、高分辨率方法。

阴离子交换高效液相色谱法：根据电荷差异分离AS-ODN及其杂质，特别适用于分析硫代磷酸酯等带电修饰的样品。

反相高效液相色谱法：根据疏水性差异进行分离，是分析带有疏水修饰（如胆固醇）或去保护不完全产物的有效方法。

质谱法：包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和电喷雾电离质谱，用于精确测定分子量，直接验证序列和修饰。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法：传统但可靠的基于分子大小和电荷的分离方法，可用于纯度检查和粗略分子量估算。

紫外-可见分光光度法：用于AS-ODN的浓度定量、纯度评估以及热变性曲线的测定。

Sanger测序法：对克隆到载体中的AS-ODN或经过PCR扩增的产物进行测序，以获得准确的序列信息。

核磁共振波谱法：用于深入分析AS-ODN的高级结构以及精确鉴定复杂化学修饰的连接位点和构型。

液相色谱-质谱联用法：将LC的分离能力与MS的鉴定能力结合，实现对复杂混合物中AS-ODN及其杂质的在线分析与鉴定。

圆二色谱法：通过测量手性物质对左右圆偏振光吸收的差异，研究AS-ODN在溶液中的二级结构及其变化。

检测仪器设备

毛细管电泳仪：配备紫外或激光诱导荧光检测器，用于高分辨率、自动化的片段分析和纯度评估。

高效液相色谱仪：配备二极管阵列检测器、紫外检测器或荧光检测器，用于基于不同原理的色谱分离与定量分析。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪：适用于中高分子量AS-ODN的精确分子量测定，操作相对简便。

电喷雾电离质谱仪

电喷雾电离质谱仪：尤其擅长分析极性大分子，能提供高精度的分子量信息，常与液相色谱联用。

紫外-可见分光光度计：用于常规的核酸浓度测定、纯度比值计算以及熔解温度测定。

DNA测序仪：基于毛细管电泳或下一代测序原理，用于获取AS-ODN克隆或PCR产物的准确序列。

核磁共振波谱仪：高场强的NMR用于解析AS-ODN的原子级结构信息及动态特性。

圆二色谱光谱仪：专门用于研究AS-ODN等生物大分子的手性及二级结构构象。

凝胶成像系统

凝胶成像系统：用于对琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳结果进行拍照、记录和定量分析。

实时荧光定量PCR仪

实时荧光定量PCR仪：在生物活性验证中，用于精确检测AS-ODN对靶mRNA水平的抑制效果。

生物分析仪

生物分析仪：基于微流控芯片技术，自动化完成核酸样品的定量、完整性及大小分布分析。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件