凋亡相关蛋白印迹

检测项目

凋亡诱导蛋白检测：指检测在凋亡信号刺激下表达上调或活化的促凋亡蛋白，如Bax、Bid等。

凋亡抑制蛋白检测：指检测能够阻止或延缓细胞凋亡进程的蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL等。

Caspase家族蛋白检测：指检测凋亡执行的关键蛋白酶家族成员，包括其酶原（Procaspase）和活化片段（Cleaved form）。

线粒体途径标志蛋白检测：指检测与线粒体膜通透性改变及细胞色素C释放相关的蛋白。

死亡受体途径标志蛋白检测：指检测由Fas、TNF-R等死亡受体激活所触发的信号蛋白。

多聚ADP核糖聚合酶检测：指检测PARP蛋白，其被Caspase-3切割产生的89 kDa片段是凋亡发生的经典标志。

磷酸化蛋白检测：指检测特定蛋白的磷酸化状态，如Bad蛋白在Ser136位点的磷酸化可抑制其促凋亡活性。

内参蛋白检测：指检测在样品中表达相对稳定的管家蛋白，如β-actin、GAPDH，用于校正上样量差异。

切割产物检测：指特异性检测蛋白被蛋白酶（主要是Caspases）切割后产生的具有活性的小片段。

蛋白二聚化/寡聚化检测：指在非还原条件下检测如Bax蛋白的寡聚化状态，这与线粒体膜孔道形成密切相关。

检测范围

Bcl-2家族蛋白：包括抗凋亡成员（如Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1）和促凋亡成员（如Bax, Bak, Bad, Bid）。

起始Caspases：如Caspase-2, -8, -9, -10，负责接收凋亡信号并启动蛋白酶级联反应。

效应Caspases：如Caspase-3, -6, -7，负责切割多种细胞底物，直接导致细胞凋亡形态学改变。

细胞色素C：从线粒体释放至胞质是内在凋亡途径的关键事件，可通过胞质组分检测。

凋亡抑制因子家族：如XIAP, cIAP1/2，通过直接抑制Caspase活性来调控凋亡。

死亡受体及其配体：如Fas/CD95, FasL, TNF-R1, TRAIL及其受体，介导外在凋亡途径。

p53蛋白：重要的肿瘤抑制蛋白，在DNA损伤等应激下可诱导细胞周期阻滞或凋亡。

survivin：属于凋亡抑制蛋白家族，在大多数肿瘤中高表达，与细胞分裂和凋亡抑制相关。

AIF和Endo G：线粒体释放的促凋亡因子，可介导不依赖于Caspase的细胞死亡。

Smac/DIABLO：线粒体释放的蛋白，通过拮抗IAPs的功能促进Caspase活化。

检测方法

细胞或组织总蛋白提取：使用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液裂解样本，离心取上清获得总蛋白。

蛋白浓度测定：采用BCA法或Bradford法对提取的蛋白样品进行精确定量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：根据目标蛋白分子量配制合适浓度的分离胶，使蛋白按分子量大小分离。

蛋白转膜：采用湿转或半干转法将凝胶中分离的蛋白转移至PVDF或NC膜上。

膜封闭：使用5%脱脂牛奶或BSA的TBST溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景。

一抗孵育：用针对特定凋亡蛋白的一抗（如抗-Cleaved Caspase-3、抗-Bax）与膜在4℃下孵育过夜。

洗膜：使用TBST缓冲液多次洗涤膜，以去除未特异性结合的一抗。

二抗孵育：用与一抗种属匹配的、偶联辣根过氧化物酶（HRP）的二抗室温孵育膜1-2小时。

化学发光显影：在膜上滴加ECL发光底物，通过HRP催化反应产生化学发光信号。

图像采集与分析：使用化学发光成像系统采集信号，并用图像分析软件对条带灰度值进行定量分析。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，实现蛋白样品的按分子量分离。

转印装置：包括转印槽和电源，用于将凝胶中的蛋白电转移至固相膜上。

化学发光成像系统：核心检测设备，用于捕获和记录ECL底物发出的微弱化学发光信号。

微量分光光度计：用于快速、准确地测定蛋白样品的浓度。

高速低温离心机：用于细胞或组织裂解后分离上清液，获取可溶性总蛋白。

电动匀浆器或超声破碎仪：用于处理坚韧的组织样本，使其充分裂解。

恒温摇床：用于一抗、二抗孵育及洗膜过程中的温和振荡，确保反应均匀充分。

精密电子天平：用于精确称量化学试剂、丙烯酰胺等，配制各种溶液和凝胶。

pH计：用于精确调节电泳缓冲液、转膜缓冲液等关键溶液的pH值。

超纯水系统：提供实验所需的超纯水，用于配制所有溶液，避免离子杂质干扰。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件