间隙连接蛋白乙酰化修饰免疫共沉淀测试

检测项目

目标蛋白特异性富集：利用特异性抗体，从复杂细胞裂解液中特异性捕获并富集目标间隙连接蛋白（如Cx43）。

乙酰化修饰水平检测：验证并检测被富集的间隙连接蛋白上是否存在乙酰化修饰，以及修饰的相对水平。

相互作用蛋白筛选：鉴定与乙酰化修饰状态下的间隙连接蛋白发生特异性相互作用的伴侣蛋白。

修饰位点初步定位：结合质谱分析，初步确定乙酰化修饰可能发生的赖氨酸残基位点。

修饰动态变化分析：比较不同处理条件（如药物刺激、基因敲低）下，蛋白乙酰化修饰水平的动态变化。

抗体特异性验证：通过设立对照，验证用于免疫沉淀的抗体对目标蛋白的特异性结合能力。

蛋白复合物完整性评估：评估在温和裂解条件下，与间隙连接蛋白形成的天然复合物是否被完整保留。

修饰与功能的关联研究：为研究乙酰化修饰如何影响间隙连接蛋白的组装、运输或功能提供生化证据。

信号通路关联分析：探究特定信号通路（如去乙酰化酶抑制剂处理）对间隙连接蛋白乙酰化状态的影响。

疾病模型中的应用检测：在特定疾病细胞或动物模型组织中，检测间隙连接蛋白乙酰化修饰的异常情况。

检测范围

多种间隙连接蛋白亚型：适用于Cx43、Cx32、Cx26等多种连接蛋白亚型的乙酰化修饰研究。

不同细胞类型：可应用于心肌细胞、肝细胞、神经元、上皮细胞等多种表达间隙连接蛋白的细胞系。

组织样本：适用于从动物模型或临床样本中提取的心脏、肝脏、脑等组织裂解液。

过表达系统：适用于在HEK293T等细胞中过表达带标签（如Flag、HA）的间隙连接蛋白的检测。

内源性蛋白检测：主要针对细胞内源性表达的、未经人工标记的天然间隙连接蛋白。

特定亚细胞组分：可针对性研究细胞膜上已组装的、或细胞内运输中的间隙连接蛋白池。

不同生理状态样本：涵盖正常生理状态、应激状态（如缺血、氧化应激）下的样本检测。

药物处理样本：适用于经去乙酰化酶抑制剂（如TSA）、激动剂或其他小分子药物处理后的样本。

基因操作样本：适用于对乙酰化相关酶类（如乙酰转移酶、去乙酰化酶）进行敲低或过表达后的样本。

发育与分化阶段样本：可用于研究不同发育阶段或细胞分化过程中，蛋白乙酰化修饰的变化。

检测方法

细胞培养与处理：培养目标细胞，根据实验设计进行药物刺激、转染或其它处理。

细胞裂解与样品制备：使用温和的NP-40或RIPA裂解液（含蛋白酶和去乙酰化酶抑制剂）制备总蛋白样品。

抗体-琼脂糖珠复合物制备：将针对目标间隙连接蛋白的特异性抗体与Protein A/G琼脂糖珠在低温下孵育结合。

免疫沉淀反应：将抗体-珠子复合物与细胞裂解液共孵育，使目标蛋白及其互作复合物被特异性捕获。

洗涤与去除非特异性结合：用预冷的裂解液多次洗涤琼脂糖珠，彻底去除非特异性吸附的杂蛋白。

洗脱与样品变性：使用含有SDS的上样缓冲液，加热洗脱并变性结合在珠子上的免疫沉淀复合物。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将洗脱的样品进行SDS-PAGE，依据分子量大小分离蛋白质。

蛋白质免疫印迹分析：将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜，进行Western Blot分析。

乙酰化修饰检测：使用抗乙酰化赖氨酸的特异性抗体进行孵育和显影，检测目标条带。

数据采集与分析：使用化学发光成像系统采集信号，通过软件分析条带灰度值，进行半定量分析。

检测仪器设备

二氧化碳细胞培养箱：用于维持细胞在恒定的温度、湿度和CO2浓度下生长。

生物安全柜：为细胞操作和无菌实验提供洁净的工作环境。

低温高速离心机：用于细胞收集、裂解液澄清以及免疫沉淀过程中的样品离心。

垂直电泳系统：用于执行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白质样品。

湿式转印系统：将电泳后的蛋白质从凝胶转移至固相支持膜（如PVDF膜）上。

化学发光成像系统：用于检测和采集Western Blot膜上化学发光或荧光信号的高灵敏度成像设备。

水平摇床：用于免疫沉淀、抗体孵育和膜洗涤过程中的温和振荡混匀。

恒温水浴锅或金属浴：用于样品加热变性，以及提供恒温孵育条件。

微量分光光度计：用于精确测量蛋白质样品的浓度，确保上样量一致。

-80°C超低温冰箱：用于长期保存细胞、组织样本、提取的蛋白质以及关键试剂。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件