蛋白磷酸化测试

检测项目

丝氨酸磷酸化水平检测：定量分析蛋白质丝氨酸残基上的磷酸化修饰程度，是研究细胞信号转导的核心指标。

苏氨酸磷酸化水平检测：测定蛋白质苏氨酸残基的磷酸化状态，对细胞周期和代谢调控研究至关重要。

酪氨酸磷酸化水平检测：检测酪氨酸残基的磷酸化，常用于研究生长因子受体和癌症相关信号通路。

磷酸化位点鉴定：精确确定蛋白质上发生磷酸化的特定氨基酸残基位置。

磷酸化动力学分析：监测磷酸化修饰随时间变化的动态过程，揭示信号事件的时序性。

激酶活性测定：通过检测底物磷酸化水平来间接评估特定激酶的催化活性。

磷酸酶活性测定：通过检测磷酸化底物的去磷酸化程度来评估磷酸酶的活性。

全局磷酸化蛋白质组分析：大规模鉴定和定量细胞或组织样本中所有磷酸化蛋白质。

信号通路磷酸化谱分析：针对特定信号通路中的多个关键蛋白，同时检测其磷酸化状态。

磷酸化依赖性蛋白相互作用：检测因磷酸化修饰而发生或解离的蛋白质-蛋白质相互作用。

检测范围

细胞裂解液：从培养细胞中提取的蛋白质混合物，是进行磷酸化检测最常用的样本类型。

组织匀浆液：来自动物或临床组织的样本，用于研究生理或病理状态下的磷酸化事件。

血清/血浆样本：检测循环血液中蛋白质的磷酸化状态，寻找潜在的疾病生物标志物。

免疫沉淀产物：通过抗体富集特定目标蛋白后，对其磷酸化状态进行高特异性分析。

重组蛋白：在体外系统中表达的纯化蛋白，用于研究特定激酶或磷酸酶的作用。

亚细胞组分：如细胞核、线粒体、质膜等分离组分，用于定位磷酸化事件发生的区域。

植物提取物：应用于植物生物学研究，分析植物信号转导和环境应激响应。

细菌/酵母裂解物：用于微生物学研究，探索原核及真核微生物中的磷酸化调控网络。

临床病理标本：如石蜡包埋组织切片，用于回顾性研究疾病与蛋白质磷酸化的关联。

药物处理样本：评估激酶抑制剂或激动剂等药物对细胞内磷酸化信号的影响。

检测方法

Western Blot（免疫印迹）：使用特异性抗磷酸化抗体对目标蛋白进行半定量检测，是最经典、应用最广的方法。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：基于微孔板的定量方法，适合高通量筛选和临床样本分析。

质谱分析法（MS）：特别是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），用于高通量、精准的磷酸化位点鉴定和定量。

流式细胞术（Phospho-Flow）：在单细胞水平上同时检测多个信号蛋白的磷酸化状态，分析细胞异质性。

免疫组织化学/免疫荧光（IHC/IF）：在组织切片或细胞爬片上原位可视化磷酸化蛋白的分布与表达水平。

放射性同位素标记法（32P/33P）：利用γ-32P-ATP作为磷酸供体，直接标记新生磷酸基团，灵敏度极高。

蛋白质/肽芯片技术：将大量蛋白质或肽段固定在芯片上，平行检测其磷酸化状态或激酶活性。

表面等离子共振（SPR）：实时、无标记地监测由磷酸化引起的生物分子间相互作用的动力学变化。

荧光偏振（FP）技术：基于荧光标记肽段磷酸化前后偏振光变化，用于激酶/磷酸酶的高通量活性筛选。

电化学发光检测（ECL）：一种高灵敏度的免疫检测技术，常用于自动化仪器平台进行磷酸化蛋白定量。

检测仪器设备

SDS-PAGE电泳系统：用于Western Blot前根据分子量分离蛋白质的核心设备。

化学发光/荧光成像系统：捕获和定量Western Blot、凝胶等膜或胶片上的化学发光或荧光信号。

酶标仪（微孔板阅读器）：读取ELISA、荧光偏振等基于微孔板实验的光吸收或荧光强度值。

液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）

流式细胞仪：用于Phospho-Flow分析，能够快速分析成千上万个单细胞的磷酸化信号。

激光共聚焦显微镜：高分辨率地进行免疫荧光染色样本的成像，观察磷酸化蛋白的亚细胞定位。

自动化Western blot系统

蛋白质芯片扫描仪

表面等离子共振仪（SPR）

实时细胞分析仪（RTCA）

检测流程