泛素化降解途径测试

检测项目

泛素-蛋白质结合物检测：通过免疫共沉淀或Pull-down技术，检测目标蛋白是否被泛素分子共价修饰。

多聚泛素链类型分析：鉴定连接在底物蛋白上的泛素链类型，如K48连接（主要介导降解）或K63连接（主要介导信号传导）。

蛋白酶体活性测定：评估26S蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和 caspase 样三种水解肽键的活性。

E1酶激活活性检测：测量泛素激活酶（E1）催化泛素形成泛素-腺苷酸中间体的能力。

E2酶结合与转移活性检测：分析泛素结合酶（E2）与E1和E3的相互作用，以及其将泛素转移至靶蛋白或E3的能力。

E3连接酶活性鉴定：确定特定的E3泛素连接酶是否能够催化底物蛋白的泛素化反应。

底物蛋白半衰期测定：使用蛋白质合成抑制剂（如环己酰亚胺）追踪目标蛋白的降解动力学，计算其半衰期。

去泛素化酶（DUB）活性分析：检测能够切割泛素链或移除底物蛋白上泛素的去泛素化酶的活性。

泛素化位点定位：利用质谱技术精确鉴定底物蛋白上被泛素修饰的特定赖氨酸残基。

泛素化依赖性降解验证：通过使用蛋白酶体抑制剂（如MG132）或过表达显性负性突变体，验证目标蛋白的降解是否依赖于泛素-蛋白酶体途径。

检测范围

细胞裂解液：从培养的哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞中提取的蛋白质样品，用于体外泛素化或蛋白酶体活性分析。

组织匀浆液：从动物模型或临床样本中获取的组织经过匀浆后得到的提取物，用于研究疾病状态下的通路变化。

重组蛋白：体外表达并纯化的目标底物蛋白、E1、E2、E3酶或DUB，用于重建和剖析泛素化反应的具体步骤。

免疫沉淀复合物：使用特异性抗体从复杂样品中富集的目标蛋白及其相互作用分子，用于分析其泛素化状态。

血液/血清样本：检测循环系统中可能与疾病相关的游离泛素、特定泛素化蛋白或蛋白酶体活性。

植物提取物：研究植物体内特有的泛素化系统及其在生长发育和应激反应中的作用。

原代细胞：直接从组织中分离培养的细胞，能更真实地反映生物体内泛素化途径的功能状态。

亚细胞组分：如细胞核、线粒体、内质网等分离组分，用于研究泛素化途径的区室化特异性功能。

病原体感染细胞模型：研究病毒或细菌感染如何劫持或干扰宿主细胞的泛素化系统。

药物处理样本：评估小分子抑制剂、激活剂或候选药物对泛素化途径关键节点的影响。

检测方法

免疫印迹（Western Blot）：使用抗泛素、抗多聚泛素链特异性或抗底物蛋白抗体，直接检测样品中蛋白的泛素化修饰水平。

免疫共沉淀（Co-IP）：利用抗体捕获目标蛋白，随后通过免疫印迹检测其结合的泛素分子或E3连接酶。

Pull-down实验：使用GST或His标签纯化的泛素或泛素相关蛋白作为“诱饵”，从裂解液中捕获相互作用的蛋白质。

体外泛素化反应：在含有ATP、纯化的E1、E2、E3酶和底物蛋白的体系中重建泛素化过程，直接验证酶活性和底物特异性。

荧光共振能量转移（FRET）：利用标记了供体和受体荧光基团的泛素和底物蛋白，实时监测活细胞内蛋白质的泛素化动力学。

报告基因降解实验：构建将目标蛋白降解信号域与荧光蛋白或荧光素酶融合的报告基因，通过检测报告信号变化间接反映降解效率。

基于质谱的蛋白质组学：进行全局性分析，大规模鉴定和定量复杂样品中所有的泛素化修饰蛋白及位点。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：定量检测样品中特定泛素化蛋白或游离多聚泛素链的浓度，适用于高通量筛选。

实时荧光定量PCR（qPCR）：检测泛素化途径相关基因（如E3s, DUBs）的转录水平变化，作为功能研究的补充。

活细胞成像与延时摄影：使用荧光标记的泛素或蛋白酶体亚基，可视化观察其在细胞内的动态定位和聚集情况。

检测仪器设备

SDS-PAGE电泳系统：用于根据分子量大小分离蛋白质样品，是后续免疫印迹分析的基础设备。

蛋白质印迹（转膜）仪：将凝胶中分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上，以便进行抗体孵育和检测。

化学发光成像系统：捕获并分析免疫印迹实验中化学发光信号，对泛素化条带进行定性和半定量分析。

多功能酶标仪：用于读取基于荧光、化学发光的ELISA、蛋白酶体活性检测试剂盒的信号，实现高通量分析。

高效液相色谱仪（HPLC）：分离和纯化泛素化反应产物、多肽片段或去泛素化酶水解产物。

高分辨率质谱仪（如Q-TOF, Orbitrap）：是进行精确的泛素化位点鉴定和全局性泛素化蛋白质组学研究的核心设备。

实时荧光定量PCR仪：定量分析泛素化途径相关基因的mRNA表达水平。

共聚焦荧光显微镜：用于高分辨率观察荧光标记的泛素、蛋白酶体或底物蛋白在细胞内的共定位和动态变化。

超速离心机：用于制备亚细胞组分，分离蛋白质复合物，是研究区室化泛素化所必需的设备。

生物分子相互作用分析系统（如SPR, BLI）：实时、无标记地定量分析泛素与E1/E2/E3/DUB之间的结合动力学和亲和力。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件