膜蛋白免疫沉淀试验

检测项目

受体蛋白鉴定与富集：特异性分离细胞膜表面的受体蛋白，如G蛋白偶联受体（GPCRs）或酪氨酸激酶受体，用于后续功能研究。

膜蛋白相互作用研究：通过共免疫沉淀验证膜蛋白与其他蛋白（如信号转导分子、适配蛋白）的生理性相互作用。

膜蛋白翻译后修饰分析：富集目标膜蛋白以检测其磷酸化、糖基化、泛素化等修饰状态。

膜蛋白复合物分离：分离完整的膜蛋白多亚基复合物，用于分析其组成和结构。

抗体特异性验证：使用免疫沉淀验证针对特定膜表位抗体的特异性和结合效率。

膜蛋白表达水平半定量：通过比较不同样本中免疫沉淀产物的量，间接评估目标膜蛋白的相对表达水平。

配体结合蛋白筛选：利用标记配体或药物，寻找并分离与之结合的膜靶点蛋白。

脂筏相关蛋白研究：富集与脂筏微结构域相关的膜蛋白，研究其定位与功能。

膜蛋白稳定性检测：评估药物或突变对目标膜蛋白稳定性及降解速率的影响。

疾病生物标志物发现：从疾病模型或临床样本的膜组分中筛选差异表达的潜在标志物。

检测范围

细胞表面受体：包括离子通道受体、细胞因子受体、生长因子受体等所有定位于质膜的受体蛋白。

跨膜转运蛋白：如ABC转运蛋白、离子泵、通道蛋白等负责物质跨膜运输的蛋白。

细胞粘附分子：整合素、钙粘蛋白、选择素等介导细胞-细胞或细胞-基质相互作用的膜蛋白。

膜锚定蛋白：通过GPI锚定或脂质修饰（如豆蔻酰化）连接到膜上的蛋白质。

信号转导分子：某些与膜结合或募集到膜上发挥功能的信号蛋白，如部分小G蛋白。

病毒包膜蛋白：研究病毒（如HIV、流感病毒）表面糖蛋白与宿主细胞受体的相互作用。

细菌外膜蛋白：应用于原核生物，研究其外膜孔道蛋白或分泌系统组件。

细胞器膜蛋白：可扩展至内质网、高尔基体、线粒体等细胞器膜上的固有膜蛋白。

药物靶点蛋白：多数药物靶点为膜蛋白，Mem-IP可用于研究药物-靶点结合及下游效应。

工程化膜蛋白：对带有标签（如GFP、Flag、HA）的重组或工程化膜蛋白进行快速纯化与鉴定。

检测方法

细胞裂解与膜制备：使用温和去污剂（如DDM、CHAPS、Triton X-100）裂解细胞，并通过差速离心制备富含膜组分的裂解液。

去污剂优化选择：根据目标膜蛋白的特性，筛选能维持其天然构象和溶解性的最佳去污剂种类和浓度。

抗体-琼脂糖珠孵育：将特异性一抗或直接偶联抗体的磁珠/琼脂糖珠与膜裂解液在低温下长时间孵育，确保充分结合。

温和洗涤步骤：使用含适当去污剂的冷洗涤缓冲液多次清洗珠子，去除非特异性结合，同时防止膜蛋白沉淀。

竞争性洗脱与酸洗脱：使用过量抗原肽竞争洗脱，或使用低pH甘氨酸缓冲液进行洗脱，以获得天然活性蛋白。

SDS-PAGE电泳分析：将洗脱下来的蛋白质复合物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离不同分子量的组分。

Western Blot验证：通过免疫印迹技术，使用特异性抗体对沉淀产物中的目标蛋白及其互作蛋白进行确认。

质谱鉴定分析：将免疫沉淀产物进行胶内或溶液酶解，利用质谱技术鉴定未知的相互作用蛋白或修饰位点。

对照实验设置：必须设置同型IgG对照、无抗体珠子对照及敲低/敲除细胞阴性对照，以确保结果特异性。

交联稳定化处理：对于弱或瞬时的相互作用，可在裂解前使用可切割交联剂（如DSP）稳定膜蛋白复合物。

检测仪器设备

低温高速离心机：用于细胞、细胞器及免疫沉淀珠子的低温离心分离，防止蛋白降解。

超声波细胞破碎仪：辅助裂解细胞或剪切基因组DNA，降低裂解液粘稠度，但需谨慎避免膜蛋白变性。

旋转混合仪：确保裂解液与免疫沉淀珠子在孵育过程中充分且温和地混合接触。

磁力分离架：当使用磁性 beads 时，用于快速、无损地分离 beads 与液体。

垂直电泳系统：用于运行SDS-PAGE，分离免疫沉淀得到的蛋白质样品。

半干/湿式转印系统：将凝胶中分离的蛋白质转移至PVDF或硝酸纤维素膜上，用于后续免疫检测。

化学发光成像系统：高灵敏度地检测 Western Blot 中化学发光信号，对结果进行定性和半定量分析。

液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）：用于对免疫沉淀产物进行高通量、高精度的蛋白质鉴定与修饰分析。

酶标仪：可用于快速检测和定量某些基于比色或荧光反应的预实验或辅助分析。

-80°C超低温冰箱及液氮罐：长期保存组织样本、细胞沉淀、制备的裂解液及珍贵的抗体等试剂。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件