腺苷二磷酸核糖亲和力测定

检测项目

平衡解离常数测定：测定ADP-核糖与靶蛋白在平衡状态下的解离常数，是评价亲和力的核心参数。

结合速率常数测定：量化ADP-核糖与靶蛋白结合过程的快慢，反映相互作用的动态起始阶段。

解离速率常数测定：量化已形成的复合物解离的快慢，反映结合的稳定性与持久性。

特异性结合位点鉴定：确定ADP-核糖在靶蛋白上的精确结合区域或氨基酸残基。

竞争性结合分析：评估其他分子（如抑制剂、类似物）与ADP-核糖竞争结合同一靶点的能力。

热力学参数分析：通过测定不同温度下的结合数据，计算焓变、熵变等，揭示结合驱动的力。

化学计量比确定：确定一个靶蛋白分子能够结合多少个ADP-核糖分子。

pH依赖性分析：考察溶液pH值对ADP-核糖与靶蛋白亲和力的影响，推断涉及离子键的作用。

离子强度依赖性分析：评估盐浓度对亲和力的影响，判断静电相互作用在结合中的贡献。

突变体亲和力比较：通过对比野生型与突变体蛋白的结合数据，验证关键结合残基的功能。

检测范围

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族蛋白：如PARP1/PARP2，研究其催化产物与自身或其他蛋白的反馈调节作用。

ADP-核糖水解酶类蛋白：如PARG、ARH3，评估其与ADP-核糖聚合物底物的识别与结合特性。

含有ADP-核糖结合模块的蛋白：如宏结构域、PBZ域、WWE域等，鉴定其对不同链长与结构ADP-核糖的偏好性。

DNA损伤修复相关蛋白：研究ADP-核糖化修饰如何招募并调节修复蛋白在损伤位点的聚集。

病毒或细菌效应蛋白：检测病原体蛋白劫持宿主ADP-核糖化信号的能力及其分子机制。

潜在药物候选分子：筛选和评估能够特异性阻断或模拟ADP-核糖与靶蛋白相互作用的小分子化合物。

抗体与适配体：测定针对ADP-核糖或其衍生物的特异性抗体的亲和力与特异性。

不同链长与分支度的ADP-核糖聚合物：比较单体、寡聚体及长链聚合物与阅读器蛋白的亲和力差异。

细胞裂解液或组织提取物：在复杂混合物中鉴定并定量能与固定化ADP-核糖结合的蛋白质。

翻译后修饰模拟肽段：评估经ADP-核糖修饰的合成肽段与其结合蛋白的相互作用强度。

检测方法

等温滴定量热法：通过直接测量结合过程释放或吸收的热量，无需标记即可获得全面的热力学参数。

表面等离子共振技术：实时、无标记监测生物分子相互作用的动力学过程，获取速率常数与亲和力数据。

微量热泳动技术：基于分子在温度梯度场中的运动变化，在溶液中进行高灵敏度、低样品消耗的亲和力测定。

荧光偏振/各向异性：利用荧光标记的ADP-核糖与蛋白结合后偏振值的变化，快速测定结合常数。

酶联免疫吸附测定：采用基于抗体的夹心法或竞争法，间接定量分析ADP-核糖与蛋白的结合。

生物膜层干涉技术：通过白光干涉原理实时测量生物分子结合引起的膜层厚度变化，用于动力学分析。

差示扫描荧光法：通过监测蛋白热稳定性变化来间接推断配体结合，常用于初步筛选。

核磁共振波谱法：提供原子分辨率水平的结合信息，可用于确定结合位点及构象变化。

等温滴定量热法与质谱联用：结合ITC的热力学数据和质谱的化学计量信息，进行更全面的分析。

下拉实验与Western Blot联用：将生物素化的ADP-核糖固定在链霉亲和素珠上，从混合物中“下拉”并结合蛋白进行检测。

检测仪器设备

等温滴定量热仪：如Malvern MicroCal系列，用于精确测量生物分子相互作用的热力学参数。

表面等离子共振仪：如Cytiva Biacore系列，提供实时、无标记的相互作用动力学分析平台。

微量热泳动仪：如Monolith系列，实现纳升级样品在溶液中的高灵敏度亲和力与动力学测定。

荧光偏振读数仪

多功能酶标仪：具备荧光偏振、时间分辨荧光、吸光度等多种检测模式，可用于多种基于板的检测。

生物膜层干涉系统：如ForteBio Octet系列，提供高通量、实时的分子互作分析能力。

实时荧光定量PCR仪：部分型号配备高精度温控模块，可用于差示扫描荧光法测定蛋白热稳定性。

高分辨率核磁共振波谱仪

液相色谱-质谱联用仪

蛋白质纯化系统

检测流程