蛋白印迹免疫检测

检测项目

总蛋白定量：在电泳前对样品进行总蛋白浓度测定，以确保上样量一致，是结果可比性的基础。

目标蛋白表达水平：检测特定蛋白质在样品中的相对或绝对表达量，是Western Blot最核心的应用。

蛋白质翻译后修饰：通过特异性抗体检测蛋白质的磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修饰状态。

蛋白质剪切与活化：检测如Caspase、PARP等蛋白的剪切片段，或酶原的活化形式，常用于细胞凋亡、信号通路研究。

蛋白二聚体/多聚体形成：在非还原条件下，检测蛋白质通过二硫键或其他作用形成的复合物。

蛋白亚细胞定位指示：通过分离不同细胞组分（如胞浆、胞核、线粒体）的蛋白，间接推断目标蛋白的定位。

蛋白异构体检测：区分由于选择性剪接或不同基因编码而产生的分子量相近但功能不同的蛋白质变体。

抗体特异性验证：用于验证新制备或购入的抗体的特异性，确认其识别条带大小与预期一致。

疾病生物标志物筛查：在临床样本JianCe测与特定疾病相关的特征性蛋白表达或修饰变化。

转基因或基因敲除验证：在分子生物学实验中，验证目标基因是否成功过表达或被敲除/敲低。

检测范围

细胞裂解物：来自培养细胞系或原代细胞的整体蛋白质样品，是最常见的检测样本类型。

组织分浆液：来自动物或人体组织的蛋白质提取物，用于研究蛋白质在生理或病理组织中的表达。

血清/血浆样本：用于检测可溶性蛋白标志物，如自身免疫病中的自身抗体或某些分泌型蛋白。

细菌/酵母裂解物：用于原核或真核微生物中重组蛋白表达鉴定或内源蛋白功能研究。

植物提取物：应用于植物生理学、遗传学研究中，检测植物特定蛋白的表达变化。

亚细胞组分：如细胞核、线粒体、胞浆、膜蛋白等分离组分，用于蛋白质定位研究。

免疫共沉淀产物：用于验证蛋白质相互作用，检测与“诱饵”蛋白结合的“猎物”蛋白。

重组蛋白样品：对纯化后的重组蛋白进行鉴定和纯度分析，验证其大小和免疫反应性。

病毒/病原体蛋白：检测病毒感染的细胞中病毒蛋白的表达，或宿主对病原体反应的蛋白变化。

脑脊液等其他体液：在神经科学或临床诊断中，检测中枢神经系统特有或渗出的生物标志物。

检测方法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据分子量大小，在电场作用下分离蛋白质混合物的核心步骤。

湿转法：将凝胶中分离的蛋白质通过电转移方式原位吸附到固相膜（如PVDF、NC膜）上的经典方法。

半干转法：一种更快速、节省缓冲液的转膜方法，利用滤纸直接传导电流进行转移。

膜封闭：使用脱脂牛奶或BSA等封闭剂覆盖膜上未结合蛋白的区域，以减少非特异性抗体吸附。

一抗孵育：使用针对目标蛋白的特异性一抗与膜上的靶蛋白进行特异性结合。

二抗孵育：使用连接有报告酶（如HRP）或荧光基团的二抗，与一抗的Fc段结合进行信号放大。

化学发光法检测：最常用的方法，HRP催化底物产生化学发光，通过X光胶片或成像系统捕获信号。

荧光法检测：使用荧光标记的二抗，直接激发荧光进行检测，可实现多重检测且线性范围宽。

显色法检测：使用能产生不溶性有色沉淀的底物（如DAB/NBT），直接在膜上形成可见条带。

内参蛋白校正：同时检测如β-actin、GAPDH等看家蛋白的表达量，用于对目标蛋白信号进行均一化校正。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，其核心部件是玻璃板夹层形成的凝胶灌制与电泳空间。

电转仪：提供稳定电场，将凝胶中的蛋白质转移至固相膜的专用设备，分为湿转槽和半干转仪。

电源：为电泳和转膜过程提供可调节电压、电流和功率的稳定直流电源。

摇床：用于孵育抗体和洗涤膜时提供温和的振荡，确保试剂与膜充分且均匀接触。

化学发光成像系统：核心检测设备，包含高灵敏度CCD相机和暗箱，用于捕获和数字化化学发光信号。

荧光成像系统：配备特定波长激发光和发射光滤光片的成像仪，用于检测荧光标记的信号。

X光胶片暗盒与洗片机：传统检测方法所需，用于放置胶片曝光以及后续的自动冲洗过程。

微量分光光度计：用于精确测定蛋白质样品浓度，确保上样量准确。