体外肝微粒体稳定性试验

检测项目

代谢稳定性评估：测定候选药物在肝微粒体温孵体系中随时间变化的剩余百分比，评估其被代谢酶降解的快慢。

半衰期（t1/2）计算：根据药物浓度随时间下降的曲线，计算其在肝微粒体中的代谢半衰期，量化稳定性。

固有清除率（CLint）计算：通过体外代谢数据推算化合物的内在代谢清除能力，是预测体内药代动力学参数的关键。

酶动力学参数测定：包括米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），用于表征代谢酶对底物的亲和力和代谢能力。

代谢表型研究：通过使用特异性化学抑制剂或重组单酶，鉴定负责化合物代谢的主要细胞色素P450亚型。

种属差异比较：平行进行人、大鼠、犬、猴等不同种属肝微粒体实验，评估代谢稳定性和代谢通路的种属差异。

NADPH依赖性验证：设置不含辅因子NADPH的对照组，确认代谢反应是否依赖于I相代谢酶系统。

蛋白结合率影响评估：考察肝微粒体蛋白结合对表观代谢稳定性的影响，必要时进行校正。

时间依赖性抑制筛选：通过预温孵实验，初步检测化合物是否为代谢酶的时间依赖性抑制剂。

代谢产物初步鉴定：利用质谱等手段，对温孵样品中的主要代谢产物进行初步的结构推断与分析。

检测范围

新化学实体：药物发现阶段的全新小分子化合物，用于早期筛选高代谢稳定性的先导物。

前药：评估前药在肝微粒体中转化为活性药物的速率和效率。

天然产物活性成分：研究中药或天然提取物中单一成分的肝脏代谢特性。

候选药物优选：在结构类似的系列化合物中，筛选出代谢稳定性最佳的候选药物进行后续开发。

手性药物：分别研究其对映异构体在代谢速率和通路上可能存在的立体选择性差异。

药物相互作用评估：作为底物，考察其代谢是否可能被共服药物抑制或诱导。

仿制药一致性评价：比较仿制药与原研药活性成分的体外代谢特征，作为生物等效性评价的辅助证据。

代谢软点分析：结合代谢产物鉴定，找出化合物分子中易被代谢的位点（软点），指导结构修饰。

跨种属外推：基于动物肝微粒体数据，预测化合物在人体内的代谢行为，支持临床前到临床的转化。

法规申报支持：为药物非临床药代动力学研究提供符合监管机构要求的体外代谢数据。

检测方法

温孵体系制备：将肝微粒体、缓冲液、辅因子NADPH再生系统和待测化合物在适宜pH缓冲液中混合。

浓度与时间点设置：通常设置多个时间点（如0, 5, 15, 30, 60分钟）和合适的化合物起始浓度进行取样。

反应启动与终止：通常通过加入预温的NADPH启动反应，在设定时间点加入终止液（如含内标的乙腈）终止反应。

样品预处理：对终止后的温孵液进行离心或过滤，去除沉淀蛋白，获取澄清的上清液用于分析。

液相色谱-质谱分析：采用LC-MS/MS技术，定量分析各时间点样品中母体化合物的剩余浓度。

标准曲线与质控：使用已知浓度的标准品建立标准曲线，并设置低、中、高浓度质控样品以确保分析准确性。

数据采集与处理：采集质谱峰面积，通过标准曲线计算浓度，绘制化合物剩余百分比-时间曲线。

参数计算模型：通常采用一级动力学衰减模型拟合数据，计算半衰期和固有清除率。

对照实验设置：必须设置无辅因子对照、零时间点对照、无蛋白对照等，以排除非酶降解或基质干扰。

方法学验证：对分析方法的专属性、线性、精密度、准确度、回收率和基质效应等进行验证。

检测仪器设备

超速离心机：用于制备肝微粒体亚细胞组分，通过差速离心分离出微粒体。

恒温水浴摇床或培养箱：为肝微粒体温孵反应提供稳定且均匀的37℃环境，并保持温和振荡。

精密移液器：用于准确移取微量体积的肝微粒体悬液、底物溶液、缓冲液及终止液。

多通道移液器：提高96孔板等高通量实验模式下的加样效率和一致性。

涡旋混合器：确保反应体系各组分及终止后的样品充分混匀。

高速离心机或板式离心机：用于快速沉淀温孵终止后样品中的蛋白质，获得澄清上清液。

液相色谱仪（HPLC/UPLC）：高效分离温孵样品中的待测物、内标及可能存在的代谢产物。

三重四极杆质谱仪（LC-MS/MS）：核心检测设备，提供高灵敏度、高选择性的定量分析。

氮吹仪或真空浓缩离心机：在必要时对样品进行浓缩，以提高检测灵敏度。

生物安全柜：在处理人或动物组织来源的生物样品时，提供无菌安全的操作环境。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件