整联蛋白Western blot试验

检测项目

总整联蛋白表达量检测：检测特定整联蛋白亚基（如β1, αV, α5等）在细胞或组织裂解液中的总蛋白表达水平。

整联蛋白活化状态分析：使用构象特异性抗体区分处于非活化（低亲和力）和活化（高亲和力）状态的整联蛋白。

磷酸化位点检测：分析整联蛋白胞内尾部特定酪氨酸或丝/苏氨酸残基的磷酸化状态，反映下游信号活性。

剪切体检测：某些整联蛋白（如αV）存在前体剪切过程，可检测其成熟体与未剪切前体的比例。

二聚体形成验证：通过非还原条件电泳，初步验证α和β亚基之间二硫键连接的二聚体形成。

与配体结合能力关联分析：将Western blot结果与细胞粘附实验结合，关联蛋白表达水平与功能活性。

不同亚型鉴别：利用亚基特异性抗体，在复杂样本中鉴别表达的具体整联蛋白亚型。

膜定位富集检测：通过分离膜蛋白组分与胞浆蛋白组分，分析整联蛋白在细胞膜上的定位与富集情况。

药物或处理干预效果评估：比较不同处理组（如抑制剂、生长因子刺激）后整联蛋白表达或活化的变化。

疾病标志物筛查：在疾病模型或临床样本中，检测整联蛋白表达谱的变化，寻找潜在的生物标志物。

检测范围

贴壁培养细胞系：如HeLa、HEK293、成纤维细胞、内皮细胞等，是最常用的检测样本来源。

悬浮培养细胞：如血液癌细胞、淋巴细胞等，需注意裂解前收集方法的差异。

动物组织样本：如小鼠的肿瘤组织、肝脏、肺、脑组织等，需进行研磨和充分匀浆。

临床组织标本：手术切除的人体肿瘤或病变组织，通常以冰冻组织或石蜡包埋组织提取蛋白。

血小板裂解液：血小板活化过程中整联蛋白αIIbβ3的活化是重要研究内容。

细胞外基质沉淀物：检测与细胞外基质共沉淀的整联蛋白，分析其聚集与结合状态。

亚细胞组分：如细胞膜组分、细胞浆组分、细胞核组分等，用于研究定位。

免疫共沉淀产物：对与整联蛋白相互作用的蛋白（如talin, kindlin）进行IP后的产物进行检测。

干细胞样本：胚胎干细胞或诱导多能干细胞，研究其分化过程中整联蛋白的表达变化。

原代分离细胞：如从组织中分离的原代内皮细胞、平滑肌细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。

检测方法

样本制备与裂解：使用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA或NP-40裂解液在冰上裂解细胞或组织，离心取上清。

蛋白浓度测定：采用BCA法或Bradford法精确测定各样本的蛋白浓度，确保上样量一致。

SDS-PAGE凝胶电泳：根据目标整联蛋白分子量（通常90-150 kDa）配制适宜浓度的分离胶，进行变性和还原（或非还原）电泳。

蛋白质转膜：采用湿转或半干转法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF或NC膜上，确保大分子整联蛋白有效转移。

膜封闭：使用5%脱脂牛奶或BSA的TBST溶液室温封闭1小时，减少非特异性结合。

一抗孵育：用针对特定整联蛋白亚基或磷酸化位点的特异性一抗（如Anti-Integrin β1, Clone EP1041Y）4℃孵育过夜。

膜洗涤：用TBST缓冲液在摇床上洗涤膜3-4次，每次5-10分钟，彻底洗去未结合的一抗。

二抗孵育：根据一抗种属选择相应的HRP标记的二抗，室温孵育1小时。

化学发光显影：将ECL发光试剂均匀滴加在膜上，于化学发光成像仪或暗室中压片曝光检测信号。

数据分析与归一化：使用内参蛋白（如GAPDH, β-Actin）对目标条带灰度值进行归一化处理，进行半定量分析。

检测仪器设备

电子天平：用于精确称量化学试剂、抗体粉末及组织样本的重量。

pH计：用于精确配制各种缓冲液，确保电泳及转膜缓冲液的pH值准确。

高速低温离心机：用于裂解后样本的离心，以去除不溶物，获取澄清的蛋白上清液。

垂直板电泳槽：用于进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白质。

电转仪：用于将凝胶中分离的蛋白质条带转移至固相支持膜（PVDF/NC膜）上。

水平摇床：用于膜的封闭、抗体孵育及洗涤步骤，确保反应均匀充分。

4℃冰箱或冷柜：用于储存抗体、裂解液以及进行一抗4℃过夜孵育。

化学发光成像系统：核心检测设备，用于捕获和记录ECL试剂产生的化学发光信号，并进行图像分析。

微量移液器及吸头：用于精确移取微量液体，如上样、加抗体和试剂。

纯水系统：提供高纯度的去离子水或超纯水，用于配制所有溶液，避免杂质干扰。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件