下一代测序文库构建

检测项目

DNA样本片段化：通过物理或酶学方法将基因组DNA随机打断成特定长度范围（如150-800 bp）的片段，是文库构建的第一步。

末端修复与磷酸化：将片段化产生的粘性末端修复为平末端，并在5‘端添加磷酸基团，为后续接头连接做准备。

3‘端加“A”尾：在DNA片段的3’端添加一个腺嘌呤脱氧核苷酸，用于与接头上的“T”突出端进行互补连接，提高连接效率与特异性。

测序接头连接：将含有测序引物结合位点、索引（Barcode）序列和流动池锚定位点的双链接头连接到DNA片段两端。

接头连接产物纯化：使用磁珠或柱纯化法去除未连接的游离接头、接头二聚体及酶等杂质，富集目标片段。

文库片段大小选择：通过磁珠分选或切胶回收等方式，筛选出特定长度范围的文库片段，以确保测序数据的均一性。

文库PCR扩增：使用与接头序列互补的通用引物进行有限循环数的PCR，以富集带有完整接头的文库片段并引入样本索引。

扩增后文库纯化：对PCR产物进行纯化，去除引物二聚体、引物及酶等成分，得到高纯度的最终文库。

文库质量浓度检测：使用荧光定量或生物分析仪等方法精确测定文库的浓度与片段分布，确保其符合上机测序要求。

文库均一化与池化：将多个完成质检的个体文库按计算好的比例混合，形成可用于单次测序运行的混合文库池。

检测范围

全基因组DNA：适用于人类、动物、植物、微生物等各类生物体的全基因组重测序或从头测序研究。

目标区域捕获DNA：针对外显子组、特定基因 panel 或自定义基因组区域进行富集后的文库构建。

总RNA：适用于转录组测序，需先进行mRNA富集或rRNA去除，再反转录为cDNA进行建库。

小RNA：专门针对miRNA、siRNA等短链非编码RNA（~18-30 nt）的分离与建库。

单细胞悬液：适用于基于液滴或孔板的单细胞分离技术，进行极低起始量（pg级）的DNA或RNA建库。

循环肿瘤DNA：针对血浆中痕量的游离DNA进行超灵敏建库，用于无创产前检测或肿瘤液体活检。

染色质免疫共沉淀产物：适用于ChIP-seq研究，对与特定蛋白质结合的DNA片段进行建库。

甲基化DNA：对经过亚硫酸氢盐转化或酶学处理的DNA进行建库，用于全基因组或靶向甲基化测序。

降解或FFPE样本DNA：针对福尔马林固定石蜡包埋组织等降解严重的DNA样本进行优化的建库流程。

宏基因组DNA：直接对环境样本（如土壤、水体、肠道内容物）中的混合微生物总DNA进行建库分析。

检测方法

超声打断法：利用聚焦超声的物理剪切力将DNA随机打断，片段分布均一，适用于多种样本类型。

转座酶法：利用Tn5转座酶同时完成DNA片段化与接头连接，步骤简化，建库速度快，适用于全基因组测序。

酶切片段化法：使用非特异性核酸内切酶或限制性内切酶组合进行DNA消化，成本较低。

mRNA polyA尾捕获法：使用 oligo-dT 磁珠特异性地富集真核生物带polyA尾的mRNA，用于RNA-seq。

rRNA去除法：使用探针杂交或酶消化法选择性去除占总RNA绝大部分的rRNA，保留其他RNA类型。

链特异性建库法：在反转录或连接过程中引入链特异性标记，使得测序数据能区分转录本来源链。

多重退火环状循环扩增法：一种基于滚环扩增的全基因组扩增技术，常用于极低起始量或单细胞DNA扩增。

模板转换法：在反转录过程中引入特殊引物实现cDNA末端均一化，是许多单细胞RNA建库技术的核心。

杂交捕获法：使用与目标区域互补的生物素标记探针进行液相杂交，通过链霉亲和素磁珠捕获富集目标序列。

磁珠纯化与分选法：基于SPRI（固相可逆固定化）磁珠技术，广泛应用于建库各步骤的纯化与片段大小选择。

检测仪器设备

Covaris超声破碎仪：通过自适应聚焦声学技术实现DNA的可控、均一片段化，是高质量文库构建的金标准设备之一。

Qubit荧光定量仪：使用荧光染料特异性结合核酸，精确测定低浓度文库的浓度，灵敏度远高于紫外分光光度计。

Agilent Bioanalyzer/Tapestation：基于微流控芯片的电泳系统，用于精确分析文库的片段大小分布与完整性。

PCR仪：用于文库的末端修复、加A尾、接头连接反应以及后续的PCR扩增步骤，要求温控精准。

磁力架：与SPRI磁珠配合使用，用于核酸的纯化、分选与清洗操作，是建库流程中的基础工具。

微量分光光度计：用于快速评估核酸样本的纯度（A260/A280比值）与浓度，但灵敏度有限。

离心浓缩仪：通过真空离心或气流加热方式快速浓缩低体积的文库溶液，便于后续步骤操作。

自动化液体处理工作站：如Hamilton、Tecan等品牌设备，可实现高通量、标准化的文库构建流程，减少人为误差。

恒温金属浴/干浴器：为酶学反应（如末端修复、连接）提供稳定且均匀的温度环境。

微量核酸提取仪：用于从各类原始样本（血液、组织、细胞）中自动化提取高质量核酸作为建库起始材料。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件