Western blot交叉验证

检测项目

目标蛋白特异性验证：使用特异性抗体确认条带是否为预期目标蛋白，排除非特异性结合。

分子量大小确认：通过与预染蛋白Marker对比，验证目标条带分子量是否与理论值相符。

抗体交叉反应性评估：检测所用抗体是否与其他非目标蛋白存在交叉反应，确保信号特异性。

不同抗体靶向同一蛋白验证：使用针对同一蛋白不同表位的两种或多种抗体进行检测，结果应一致。

阳性与阴性对照设置：设立已知表达和不表达目标蛋白的样本作为对照，是结果判读的基础。

内参蛋白均一化验证：检测GAPDH、β-actin等内参蛋白表达是否均匀，以校正上样量差异。

信号线性范围确定：通过梯度上样，验证目标蛋白信号强度是否在检测系统的线性响应范围内。

磷酸化等翻译后修饰验证：对修饰蛋白，需使用修饰特异性抗体，并通过去磷酸化等处理反向验证。

不同样本类型适用性验证：验证检测方法在细胞裂解液、组织匀浆液、血清等多种样本中的适用性。

批次间重复性检验：在不同时间、由不同操作者重复实验，以评估方法的稳定性和可重复性。

检测范围

广泛分子量蛋白质：可检测从小于10 kDa的小分子多肽到大于200 kDa的大分子量蛋白质复合物。

多种物种来源样本：适用于人类、小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇等多种模式生物的样本分析。

细胞器与亚细胞组分：可对细胞核、线粒体、胞浆、膜蛋白等分离后的亚细胞组分进行蛋白定位验证。

重组蛋白与纯化蛋白：用于验证重组蛋白的表达、纯化效率及鉴定其免疫反应性。

疾病标志物筛选与验证：在肿瘤、神经退行性疾病等领域，用于潜在生物标志物的初步筛选和验证。

信号通路关键蛋白：广泛应用于MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT等信号通路中关键蛋白的表达与活化检测。

病毒与细菌抗原：用于病原体感染研究中，特定病原体蛋白在宿主内的表达检测。

基因编辑与干扰效果验证：在CRISPR/Cas9敲除、siRNA/shRNA敲低后，验证目标蛋白的表达水平变化。

药物处理效应评估：评估药物、生长因子或抑制剂处理后，特定靶点蛋白表达量或修饰状态的改变。

蛋白质相互作用间接证据：通过Co-IP结合Western blot，为蛋白质间的相互作用提供间接证据。

检测方法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据分子量大小分离蛋白质混合物的核心第一步。

湿转或半干转转膜：将凝胶中分离的蛋白质转移至PVDF或NC膜上，以固定并进行后续检测。

封闭：使用BSA或脱脂牛奶封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景噪音。

一抗孵育：使用针对目标蛋白的特异性一抗与膜上的靶蛋白进行特异性结合。

二抗孵育：使用偶联HRP或荧光基团的二抗与一抗结合，用于信号放大和检测。

化学发光（ECL）检测：最常用的方法，通过HRP催化底物产生化学发光信号并被成像系统捕获。

荧光Western blot检测：使用荧光标记二抗，可直接扫描成像，允许多重检测且动态范围更宽。

剥离与重孵育：使用温和的剥离缓冲液洗掉一抗二抗，以便在同一张膜上检测其他蛋白。

图像获取与定量分析：使用化学发光成像仪或荧光扫描仪获取图像，并用软件进行条带灰度值定量。

数据归一化与统计分析：将目标蛋白信号与内参蛋白信号比值进行归一化，并采用适当的统计方法分析组间差异。

检测仪器设备

垂直电泳槽：用于进行SDS-PAGE，实现蛋白质按分子量大小分离的关键装置。

转印槽（湿转）或半干转印仪：用于将凝胶中的蛋白质高效、均匀地转移至固相支持膜上。

精密电子天平：用于准确称量试剂、药品，保证溶液配制和样品准备的准确性。

pH计：用于精确测量和调整电泳缓冲液、转膜缓冲液等关键溶液的pH值。

高速低温离心机：用于快速低温离心样本，制备高质量的无杂质细胞或组织裂解液。

涡旋振荡器与旋转摇床：用于充分混匀样品、试剂，以及孵育过程中保证抗体与膜充分接触。

化学发光成像系统或荧光扫描仪：核心检测设备，用于捕获和记录Western blot的微弱化学发光或荧光信号。

超纯水系统：提供无离子、无核酸酶/蛋白酶污染的纯水，是配制所有试剂的基础。

微量移液器及电泳专用加样枪头：用于精确吸取和上样微量体积的蛋白样品和预染Marker。

凝胶成像分析软件：集成于成像系统或独立的正规软件，用于图像获取、条带定量和数据分析。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件