染色质免疫共沉淀靶点验证

检测项目

ChIP-qPCR验证：使用定量PCR对ChIP富集的DNA片段进行精确定量，验证特定基因组位点的结合。

报告基因活性检测：将推测的靶基因启动子或调控序列克隆至报告载体，检测其转录活性是否受目标蛋白调控。

凝胶迁移实验（EMSA）：在体外验证目标蛋白与推测DNA探针的直接结合能力。

染色质构象捕获（3C）及其衍生技术：验证目标蛋白结合位点与远端基因启动子之间的空间相互作用。

基因敲低/敲除功能验证：通过RNAi或CRISPR技术降低/消除目标蛋白表达，观察靶基因表达水平变化。

基因过表达功能验证：过表达目标蛋白，检测其对推测靶基因mRNA或蛋白水平的影响。

Western Blotting验证：在蛋白水平检测靶基因的表达变化，与mRNA水平结果相互印证。

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）：在mRNA水平检测靶基因的表达变化，是功能验证的核心手段。

免疫荧光共定位：在细胞核内观察目标蛋白与特定基因组区域或转录因子的空间共定位情况。

定点突变验证：对推测的结合序列进行定点突变，观察其对蛋白结合能力及基因调控功能的影响。

检测范围

核心启动子区域：验证目标蛋白是否结合在转录起始位点附近的核心启动子序列上。

增强子/沉默子区域：验证远端调控元件（增强子或沉默子）是否为该蛋白的功能性结合位点。

CpG岛甲基化状态：检测靶点区域DNA甲基化水平，分析与蛋白结合及基因沉默的关联。

组蛋白修饰共定位：分析目标蛋白结合位点与特定激活性或抑制性组蛋白修饰（如H3K4me3， H3K27me3）的重叠情况。

多基因家族成员：当目标蛋白可能调控具有相似序列的多个基因时，需对家族成员进行逐一或代表性验证。

不同细胞类型或状态：在多种相关细胞系、原代细胞或不同处理条件（如分化、应激）下验证结合的普适性或特异性。

物种间保守性：比较不同物种间该结合序列的保守性，评估其功能重要性。

全基因组关联位点：若ChIP靶点与GWAS发现的疾病风险位点重合，需重点验证其调控功能。

可变剪接调控区：验证目标蛋白是否结合在内含子或外显子区域，参与RNA剪接调控。

：验证目标蛋白对miRNA、lncRNA等非编码RNA转录的调控作用。

检测方法

SYBR Green qPCR法：使用SYBR Green染料进行ChIP-qPCR，成本低，需配合熔解曲线确保引物特异性。

TaqMan探针qPCR法：使用序列特异性探针进行ChIP-qPCR，特异性更高，适用于重复序列或多重检测。

双荧光素酶报告基因检测：将海肾荧光素酶作为内参，萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，进行标准化定量。

电泳迁移率变动分析（EMSA）：通过非变性凝胶电泳分离蛋白-DNA复合物与游离探针，验证直接结合。

超敏DNase I足迹法：用于精确绘制目标蛋白在DNA上的结合位点（“足迹”区域）。

染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）交叉验证：使用另一批次独立ChIP样本或不同抗体进行二次ChIP-seq，验证原始峰的可重复性。

：提取总RNA并反转录为cDNA，使用qPCR定量靶基因mRNA表达量。

：通过SDS-PAGE分离蛋白，转膜后使用特异性抗体检测靶蛋白表达水平。

：设计合成针对目标蛋白或靶基因的siRNA或shRNA，转染细胞后观察效应。

：利用CRISPR技术敲除目标蛋白基因或删除其DNA结合位点，进行功能丧失性验证。

检测仪器设备

实时荧光定量PCR仪：进行ChIP-qPCR和RT-qPCR的核心设备，用于DNA和cDNA的绝对或相对定量。

凝胶成像系统：用于观察和记录EMSA、Western Blot、常规核酸电泳等实验的凝胶图像。

化学发光成像仪：高灵敏度检测Western Blot、荧光素酶报告基因等化学发光或荧光信号。

核酸蛋白测定仪：快速精确测量DNA、RNA和蛋白质样品的浓度与纯度。

垂直电泳系统：用于蛋白质SDS-PAGE和EMSA中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

半干/湿式转印系统：将凝胶中分离的蛋白质或核酸转移至固相膜（如PVDF、尼龙膜）上。

细胞培养箱：提供恒定的温度、湿度和CO2环境，用于培养进行功能验证的各类细胞。

生物安全柜/超净工作台：提供无菌操作环境，用于细胞传代、转染等实验操作。

显微注射或电转仪：用于将报告基因质粒、siRNA或CRISPR组件高效导入细胞。

多功能酶标仪：具备吸光度、荧光和化学发光检测功能，可用于快速检测报告基因活性等。

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件