蛙病毒核酸检测

因业务调整，部分个人测试暂不接受委托，望见谅。

检测项目

样本预处理：组织匀浆与离心处理，参数包括离心力3000g，时间15min

核酸提取：磁珠法提取DNA/RNA，提取纯度要求OD260/280在1.8-2.0范围内

PCR引物设计：靶向蛙病毒MCP基因保守区，扩增片段长度200-500bp

实时荧光定量PCR：检测灵敏度达10拷贝/μL，循环阈值(Ct值)≤38为阳性判定标准

巢式PCR扩增：二次扩增提高特异性，退火温度梯度设置55-65℃

电泳分析：琼脂糖凝胶浓度1.5%，电压120V，时间30min

测序验证：Sanger法双向测序，序列相似度≥98%确认病毒型别

阳性对照设置：含靶序列的重组质粒，浓度梯度100-10⁶拷贝/μL

阴性对照设置：无核酸酶水及健康蛙组织样本

内参基因检测：β-actin基因扩增验证样本质量，Ct值≤32为有效

熔解曲线分析：熔解温度(Tm值)偏差±0.5℃判定特异性

限性稀释试验：确定病毒载量，检测下限1TCID₅₀/mL

检测范围

养殖场蝌蚪：体长20-50mm蝌蚪的肝脏及尾部组织

成体蛙表皮拭子：皮肤黏液采样面积≥4cm²

蛙卵样本：单批次检测≥100枚卵的匀浆液

水体沉积物：池塘底泥样本采集深度0-15cm

生物饵料：水蚤、摇蚊幼虫等载体生物整体制备悬液

病理组织：肝、肾、脾脏器官的10%组织匀浆

运输工具表面：车厢内壁擦拭采样面积100cm²

养殖器械：网具、捕捞工具表面生物膜采集

野生蛙种群：林蛙、树蛙等野外个体的口腔拭子

两栖动物饲料：冷冻红虫、丰年虾的微生物负载检测

实验动物：模式蛙种（非洲爪蟾）的肾脏细胞培养物

疫苗产品：蛙病毒灭活疫苗的残留核酸验证

检测标准

OIEAquaticAnimalHealthCodeChapter2.1.2

ISO20307:2017动物健康监测实验室规范

GB/T34796-2017水产动物病毒核酸检测通则

NY/T3997-2021蛙类病毒病诊断技术规程

SN/T5643.1-2023出境两栖动物检疫方法

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

JJF1717-2018核酸扩增检测系统校准规范

ISO/IEC17025:2017检测实验室能力通用要求

检测仪器

生物安全柜：提供ISO5级防护环境，气流速度0.45±0.05m/s

冷冻离心机：最大转速15000rpm，温度控制范围-20℃至40℃

核酸定量仪：紫外分光光度法检测波长260/280nm，检测限0.2ng/μL

实时荧光定量PCR仪：支持四通道荧光检测，温控精度±0.1℃

电泳系统：电压范围5-300V，配套凝胶成像分析模块

超低温冰箱：-80℃样本储存，温度波动±3℃

自动核酸提取仪：并行处理32样本，磁珠回收率≥95%

梯度PCR仪：升降温速率≥5℃/秒，温控均匀性±0.25℃

检测流程

1、咨询：提品资料(说明书、规格书等)

2、确认检测用途及项目要求

3、填写检测申请表(含公司信息及产品必要信息)

4、按要求寄送样品(部分可上门取样/检测)

5、收到样品，安排费用后进行样品检测

6、检测出相关数据，编写报告草件，确认信息是否无误

7、确认完毕后出具报告正式件

8、寄送报告原件