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Western Blot验证检测

发布时间：2025-05-08

关键词：Western Blot验证检测标准,Western Blot验证项检测报价,Western Blot验证检测范围

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来源：北京中科光析科学技术研究所

文章简介：

WesternBlot验证检测是一种基于抗原-抗体特异性结合原理的蛋白质分析技术，广泛应用于目标蛋白的定性及半定量检测。其核心流程包括样品制备、电泳分离、转膜封闭、抗体孵育及信号显影等环节，需严格控制转膜效率、抗体特异性及显影灵敏度等关键参数。本方法适用于基因表达研究、疾病标志物筛选及药物靶点验证等领域。

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检测项目

Western Blot验证检测主要针对蛋白质层面的生物学研究需求设计，涵盖以下核心项目： 1. **目标蛋白表达水平分析**：通过比较不同处理组或病理状态下特定蛋白的表达差异； 2. **翻译后修饰鉴定**：包括磷酸化、泛素化及糖基化修饰位点的特异性检测； 3. **蛋白亚型区分**：基于分子量差异鉴别剪切变体或异构体； 4. **抗体特异性验证**：确认商业化或自研抗体与目标抗原的结合特异性； 5. **蛋白相互作用间接验证**：通过共沉淀样本中互作蛋白的共迁移现象分析。

检测范围

本技术适用于以下样本类型与研究领域： **样本类型**： - 细胞裂解液（贴壁/悬浮细胞） - 组织匀浆（新鲜/冻存组织） - 血清/血浆等体液样本 - 重组蛋白纯化产物 **应用领域**： - 医学基础研究：肿瘤标志物筛选、信号通路解析 - 生物制药开发：治疗性抗体效价评估 - 疾病机制研究：神经退行性疾病相关蛋白聚集检测 - 农业生物技术：转基因作物外源蛋白表达验证

检测方法

Western Blot标准操作流程包含以下关键步骤： 1. **样品制备**： - 使用RIPA裂解液提取总蛋白（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂） - BCA法测定浓度后调整上样量至20-50μg/孔 - 加入还原型Loading Buffer煮沸变性 2. **SDS-PAGE电泳**： - 根据目标蛋白分子量选择8%-15%分离胶浓度 - 恒压80V浓缩胶阶段切换至120V分离胶阶段 - 预染Marker监控电泳进程 3. **湿式转膜**： - PVDF膜甲醇活化后与凝胶组装"三明治"结构 - 恒流200mA转膜1小时（依据蛋白分子量调整时长） 4. **封闭与抗体孵育**： - 5%脱脂牛奶室温封闭1小时阻断非特异性结合 - 一抗4℃孵育过夜（稀释比例1:500-1:5000） - HRP标记二抗室温孵育1小时（稀释比例1:5000） 5. **化学发光显影**： - ECL底物均匀覆盖膜表面后避光反应1分钟 - ChemiDoc成像系统捕获信号并分析灰度值 **质控要点**： - 内参蛋白（如β-actin/GAPDH）验证上样均一性 - 阴性对照排除二抗非特异性结合 - 曝光时间梯度优化避免信号过饱和

检测仪器

Western Blot实验需配置以下正规设备： 1. **垂直电泳系统**：实现蛋白质按分子量梯度分离的核心装置，需配备制胶模具及恒压电源； 2. **半干/湿式转印仪**：完成凝胶蛋白向固相载体的高效转移； 3. **化学发光成像系统**：配备CCD相机的暗箱设备，灵敏度需达到fg级蛋白检出限； 4. **微量分光光度计**：用于BCA法等蛋白浓度定量； 5. **恒温摇床**：控制抗体孵育过程的温度与震荡频率； 6. **超纯水系统**：提供电阻率≥18.2MΩ·cm的实验用水。